酶符號抗體的制備辦法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。 
（1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功用團試劑，它可以使酶與蛋白質的氨基通過它而聯(lián)合。堿性磷酸一般用此法進行符號。交聯(lián)辦法一步法、兩步法兩種。在一步法中戊二醛直接參加酶與抗體的混合物中，反應后即得酶符號抗體。 
ELISA中常用的酶一般都用此法交聯(lián)。它具有操作簡潔、有效（結合率達60%-70%）和重復性好等優(yōu)點。缺點是交聯(lián)反應是隨機的，酶與抗體交聯(lián)時分子間的份額不嚴格，結合物的巨細也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有或許交聯(lián)，影響效果。兩步法的產品中絕大部分的酶與蛋白質是以1:1的份額結合的，較一步法的酶結合物更有助于本底的改進以提高敏感度，但其偶聯(lián)的有效率較一步法低。 
（2）過碘酸鹽氧化法：本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物酶的符號常用此法。反應時，過碘酸鈉將HRP分子外表的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質上的氨基構成Schiff氏堿而結合。
按以上辦法制備的酶結合物一般都混有未結合物的酶和抗體。理論上，結合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中zui后的酶活性測定，因通過*洗滌，游離酶可被除掉，并不影響顯色。但游離的抗體則不同，它會與酶標抗體競爭相應的固相抗原，從而減少了斷合到固相上的酶標抗體的量。